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材料與方法
材料 ELISA試劑盒
主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Queue公司);豬ELISA試劑盒潔凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠);生物倒置顯微鏡(日本歐林巴斯光學(xué)株式會社);酶標(biāo)分析儀(瑞士SUNRIS公司);ELISA試劑盒價格電子分析天平(瑞士Mettler公司);上海ELISA試劑盒低溫高速離心機(德國Hermle公司);電泳儀(美國BIO-RAD公司)等。
試劑 AFB1-BSA、禽ELISA試劑盒黃曲霍毒素(B+G)(Aflatoxin B+G)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)黃曲霉毒素B2(Aflatoxin B2,AFB2)白介素ELISA試劑盒、黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)、黃曲霉毒素G2(Aflatoxin G2,AFG2)、T-2毒素(T-2toxin)、赭曲霉毒素A(OchratoxinA)、展青霉素(Patulin)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivslenol,DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、匙孔嘁血藍素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、伏馬菌素B1、抗體亞類測定試劑盒(IgM,IgG,IgA,IgD,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3)(美國Sigma公司);RPMI1640培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、福氏佐劑(*、不*)、二甲基亞砜(DMSO)、吐溫20(Tween20)、聚乙二醇(PEG,MW5000)、青霉素,鏈霉素(美圍Gibco公司);辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山試劑公司);30%H2O2(優(yōu)級純,北京化工廠)。
溶液系統(tǒng)ELISA使用液 參考文獻[3]制備。
細(xì)胞系與實驗動物 小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0由本室傳代,并經(jīng)8一氮雜鳥嘌呤處理。雌性BALB/c小鼠,體重18~20g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所動物繁育場)。
抗總黃曲霉毒素雜交瘤細(xì)胞株 本研究室自制。
方法
單克隆抗體生產(chǎn) 將抗總黃曲霉毒素雜交瘤細(xì)胞注入BALB/c小鼠腹腔,獲得含抗總黃曲霉毒素單克隆抗體的腹水,并將所得腹水采用飽和硫酸銨鹽析法進行純化〔4〕。
抗體特性鑒定 抗體的免疫球蛋白類別及亞類鑒定采用抗體亞類鑒定試劑盒;抗體的純度及分子量用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定;IgG含量采用二喹呆甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒進行測定;抗體滴度測定采用間接非競爭ELISA方法:以AFB1-BSA為包被抗原,從1:10000倍開始將抗體進行倍比稀釋,以Sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對照,以(A試驗-A空白)/(A對照-A空白)≥21的zui大稀釋倍數(shù)為滴定終點;抗體的特異性和抗體的靈敏度用間接競爭抑制性ELISA法進行測定,參試毒素為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、赭曲霉素A(OA)、伏馬菌素B1、T-2毒素和載體蛋白BSA。
試劑盒各項技術(shù)參數(shù)研究
方法的檢出限(靈敏度) 用間接非競爭ELISA法作抗體滴度測定,找出合適的抗體工作濃度。再用間接競爭ELISA法作棋盤滴定,找出合適的包被濃度與毒素的競爭濃度,zui后作標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定線性范圍及檢出限。
方法的回收率試驗 根據(jù)試劑盒的檢測范圍確定加標(biāo)濃度,在不含黃曲霉毒素的玉米和花生樣品中分別進行高、低2個濃度的加標(biāo)回收試驗,每個加標(biāo)水平做5個重復(fù)的平行樣。樣品的提取方法為:樣品粉碎后使其90%通過250~500μm網(wǎng)篩。稱取5g加到100ml具塞三角燒瓶中,加入05g NaCl及25ml甲醇水溶液(70:30,v/v),劇烈震蕩30min后過濾。濾液用純水稀釋10倍進行檢測。樣品中黃曲霉毒素濃度(μg/Kg)=CDX/W。式中:C-酶標(biāo)板上測的黃曲霉毒素濃度(ng/ml),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得;D-樣品提取液的體積(ml);X-稀釋倍數(shù);W-樣品重量(g)。
黃曲霉毒素(Aflatoxin)是黃曲霉(XspeEillusflavus)和寄生曲霉(Aparasiticus)等產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似ELISA試劑盒的次生代謝產(chǎn)物。據(jù)Gabal等〔1〕報道,有40%的黃曲霉菌株培養(yǎng)物可同時測出黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)。上海ELISA試劑盒同時黃曲霉毒素的毒性具有協(xié)同作用,因此,豬ELISA試劑盒90%以上的國家都制定了食品中總黃曲霉毒素的*。目前總黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層層析法、色譜法。ELISA試劑盒價格我國執(zhí)行的食品中總黃曲霉毒素B1+B2+G1+G2的國家標(biāo)準(zhǔn)測定方法是薄層色譜法和微柱篩選法,白介素ELISA試劑盒均為目測半定量法,zui低檢出濃度為5μg/kg〔2〕。禽ELISA試劑盒這些方法因受本身的限制,度低、敏感性差;樣品前處理過程復(fù)雜費時;或需要價格昂貴的儀器,檢測成本高,難以推廣應(yīng)用,影響了糧油食品中黃曲霉毒素的有效監(jiān)測。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是在免疫學(xué)和細(xì)胞工程學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展的一種微量檢測技術(shù),特別適合于對黃曲霉毒素污染監(jiān)控中大量樣本的篩檢。本研究以B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以能分泌抗總黃曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為基礎(chǔ),建立了檢測玉米、花生中總黃曲霉毒素的ELISA檢測方法,并初步研制出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的ELISA試劑盒。
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